技術文章/ARTICLES

大腸桿菌細胞制備流程
*天： 
1. 將適合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他營養豐富的培養基上，在37°C下培養 
2. 高溫滅菌大的離心瓶(250-500ml)以備第二天搖瓶用 
3. 準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用 
第二天： 
4. 轉移0.2-1ml培養物至裝有500ml LB(或其他營養豐富的培養基)的1-2升搖瓶 
5. 37°C下劇烈振蕩培養2-6小時 
6. 定時監控OD600值(培養1小時后每半小時測定一次) 
7. 當OD600值達到0.5-1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15分鐘(需要的話這種方式可以存放培養液數小時) 
8. 細胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天) 
9. 用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。 
10. 照上面步驟重復離心，小心棄去上清液 
11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞 
12. 離心，棄上清液 
13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞 
14. 照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉淀可能會很松散) 
15. 用10%甘油重懸浮細胞至zui終體積為2-3ml 
16. 將細胞按150μl等份裝入微量離心管，于-80°C保存 
轉化方法： 
1. 在冰上解凍電感受態細胞添加1-10μl DNA，冰上培育約5分鐘 
2. 添加1-3μl DNA，冰上培育約5分鐘 
3. 轉移DNA/細胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器(無泡)中 
4. 加載P1000，準備好300μl LB 或 2xYT 
5. 對電穿孔容器進行脈沖(200 歐姆， 25μFd，2.5 千伏)(檢查時間常數，應該在3以上) 
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中 
7. 37°C下培養細胞40分鐘至1小時以復原 
8. 轉移細胞至適當的選擇培養基上培養