技術文章/ARTICLES

    通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降 解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。細胞

    在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced   silencingcomplex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離 siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。

    另外，還有研究證明含有啟動子區的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.
實驗步驟

1. siRNA的設計

1) 在設計RNAi實驗時，可以先在以下進行目標序列的篩選：

2) RNAi目標序列的選取原則：

A.從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA"二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示 GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結 合mRNA從而影響siRNA的效果。細胞

B. 將潛在序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

C. 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。

3) 陰性對照

    一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。