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    骨髓作為主要的造血場所，可進行體外培養。在無菌條件下，把骨髓細胞分離出來，置于培養系統中，在合適的環境中，提供營養物質，使其繼續生存或生長。通過培養骨髓，可見到造血干細胞不同分化階段時各種血細胞的前驅細胞。用通常的形態學方法不可能識別造血干細胞和各種血細胞的前驅細胞，但在加入各種造血因子的半固體培養基進行培養后，可出現單個前驅血細胞的增殖、分化，并形成細胞克隆。

一、材料

1．實驗動物小鼠(C57BL／6\B6D2Fl等)2只。

2．培養液瓊脂(Difco)、a—MEM、FBS(用新生牛血清、人血清也可)。

3．器具吸管、試管、注射器、25ml培養瓶、35mm塑料培養皿、血細胞計數器、解利用具、倒置顯微鏡、解剖顯微鏡。

4．試劑Turk液(白細胞稀釋液)。

二、方法

1．軟瓊脂培養液的制備將瓊脂30mg置于一試管中，加蒸餾水3ml，103．4kPa高壓滅菌，待冷卻至50℃～60℃時加2倍濃度的a-MEM等量混合，置于42℃水浴中保溫。

2．取材小鼠經麻醉處死，全身浸泡于75％乙醇中消毒5min，拎出后將小鼠仰面翻鋪于超凈臺上一個消毒托盤上。用眼科鑷小心捏起小鼠兩髖關節之間的腹部皮膚，用眼科剪小心剪開皮膚，并分離兩下肢的皮膚，往下在腳踝處剪斷，往上在髖關節處剪斷，這樣可以游離出小鼠的兩條下肢。將它們放入另外一個消毒托盤中，并換一套新的剪子和鑷子。手術器械事先均必須消毒。

3．骨髓細胞的制備剝離肌肉，切除兩側股股，去除周圍肌肉組織后放人35mm塑料培養皿中，切除兩側骨的端部，用吸有a—MEM培養液的注射器沖壓出骨髓于一短試管中，霜10ml吸管吹打骨髓團塊后放置10min，將懸浮的細胞移植到另一試管中。取細胞懸液0.1ml與Turk液O．9ml混合，用血細胞計數器計數有核細胞數。根據計數，用a—MEM將骨髓細胞濃度稀釋成5×105／ml。

4．細胞接種取骨髓細胞懸液0．5ml、條件培養液O．5ml及FBS lml，混合于無菌試管中：加42℃軟瓊脂培養液3ml，迅速混合后移至35mm塑料培養皿中，使整個平皿底部鋪平(注意：此操作的動作要快，溫度不能太低，瓊脂不能在未分裝前就凝固于試管中)。靜置10min后瓊脂板可*凝固，置37℃、5％CO2孵箱內培養7d。

5．顯微鏡觀察與克隆計數低倍率(40～100倍)的倒置顯微鏡或解剖顯微鏡下計數克隆數，含有50個以上的細胞計數一個克隆，正常骨髓的發生率為100～200個／105個骨髓細胞。