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    獲得穩定的雜交瘤細胞系后，即可根據需要大量單抗，以用于不同目的。

一、單抗的大規模制備

    目前大量制備單抗的方法主要有兩大系統，一是動物體內法，這是國內外實驗室所廣泛采用；另一是體外培養法。

1、動物體內單抗的方法

    迄今為止，通常情況下均采用動物體內單抗的方法，鑒于絕大多數動物用雜交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤細胞與同品系的脾細胞融合而得，因此使用的動物當然BALB/c小鼠。本方法即將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內，在小鼠腹腔內生長雜交瘤，并產生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高?？梢娫摲ú僮骱啽?、經濟，不過，腹水中?；煊行∈蟮母鞣N雜蛋白（包括Ig），因此在很多情況下要提純后才能使用，而且還有污染動物病毒的危險，故而用SPF級小鼠。

（1）材料：

a. 成年BALB/c小鼠。

b. 降植烷（Pristane）或液體石蠟。

c. 處于對數生長期的雜交瘤細胞。

（2）方法：

a. 腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml。

b. 7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養基稀釋的雜交瘤細胞，每只小鼠5×105/0.2ml。

c. 間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用16號針頭采集腹水，一般可連續采2-3次，通常每只小鼠可采 5-10ml腹水；

d. 將腹水離心（2000r/min 5分鐘），除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-70℃凍存備用，或凍干保存。

二、體外培養單抗的方法

    總體上講，雜交瘤細胞系并不是嚴格的貼壁依賴細胞（anchorage dependent cell，ADC），因此既可以進行單層細胞培養，又可以進行懸浮培養。雜交瘤細胞的單層細胞培養法是各個實驗室zui常用的手段，即將雜交瘤細胞加入培養瓶中，以含10-15%小牛血清的培養基培養，細胞濃度以1×106-2×106/ml為佳，然后收集培養上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。顯然，這種方法制備的單抗量極為有限，無疑是不適用于單抗的大規模。要想在體外大量制備單抗，就必須進行雜交瘤細胞的大量（高密度）培養。單位體積內細胞數量越多，細胞存活時間越長，單抗的濃度就越高，產量就越大。

    目前在雜交瘤細胞的大量培養中，主要有兩種類型的培養系統。其一是懸浮培養系統，采用轉瓶或發酵罐式的生物反應器，其中包括使用微載體；其二是細胞固定化培養系統，包括中空纖維細胞培養系統和微囊化細胞培養系統。

1、懸浮培養法

    目前小規模懸浮培養多采用轉瓶培養，通過攪拌使細胞呈懸浮狀態；而大規模懸浮培養多采用發酵式的生物反應器，美國、加拿大、法國和德國等幾家公司這類反應器，其培養方式可分為純批式、流加式、半連續式和連續式。

2、微載體培養法

    微載體（Microcarrier）是以小的固體顆粒作為細胞生長的載體，在攪拌作用下微載體 懸浮于培養液中，細胞則在固體顆粒表面生長成單層?？捎米骷毎罅颗囵B的微載體主要以交聯瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質的產品，其中以 Cytodex I，Biosilon和Superbeads為好。微載體培養的基本方法上與懸浮培養相同。近來的研究表明，該法是雜交瘤細胞大量培養的理想途徑之一。

3、中空纖維細胞培養系統

    該系統由中空纖維生物反應器、培養基容器、供氧器和蠕動泵等組成。用于細胞培養的中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯-丙烯復合物、多聚碳酸硅等材料制成，外徑一般為100-500um，壁厚25-75um，壁呈海綿狀，上面有許多微孔。中空纖維的內腔表面是一層半透性的超濾膜，其孔徑只允許營養物質和代謝廢物出入，而對細胞和大分子物質（如單抗等）有滯留作用。目前使用的中空纖維生物反應器分為柱式、板框式和中心灌流式。盡管該培養系統在大規模單抗時成本較低，并可獲得高產量高純度的抗體，由于設備價格昂貴，限制了其使用范圍。

4、微囊化細胞培養系統

    該系統是先將雜交瘤細胞微囊化，然后將此具有半透膜的微囊置于培養液中進行懸浮培養，一定時間后，從培養液中分離出微囊，沖洗后打開囊膜，離心后即可獲得高濃度的單抗。

    總之，上述四種體外培養單抗的方法仍處在發展之中；隨著研究的不斷深入和技術的完善，它們將會在單抗的產業化進程中發揮越來越大的作用。

三、雜交瘤細胞的無血清培養

    雜交瘤細胞的體外培養絕大多數應用DMEM或RPMI-1640為基礎培養基，添加10-20%胎?；蛐律∨Ｑ?。基礎培養基主要提供各種氨基酸、維生素、葡萄糖、無機鹽、各種合成核酸和脂質的前體物質。而血清主要供給雜交瘤細胞等各種營養成分，血清中的激素可刺激細胞生長，其中的許多蛋白質能結合有毒性的離子和熱源質而起解毒作用，同時這些蛋白質對激素、維生素和脂類有穩定和調節作用。但是，血清中含有上百種的蛋白質，這給單抗的純化帶來的麻煩，而未純化的含有異種蛋白的單抗用于動物治療可誘發變態反應；加之，血清來源有限；每批血清之間質量差異較大，直接影響結果的穩定性，同時血清是雜交瘤細胞發生支原體污染的zui主要來源之一，而且價格較貴，為了克服血清的這些缺點，采用無血清培養基培養雜交瘤細胞越來越受到廣泛重視。

    無血清培養的實質就是用各種不同的添加劑來代替血清，然后進行雜交瘤細胞的培養。目前已報道的各類無血清培養基有含有大豆類脂的、含有酪蛋白的、化學限定性的、無蛋白的、含有血清低分子量成分的無血清培養基，其中一部分已有產品出售。綜合這些無血清培養基，約有幾十種不同的添加劑可用于無血清培養基，在其中至少必須添加胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺這三種成分，才能起到類似血清的作用，其他較重要的添加劑包括白蛋白、亞油酸和油酸、抗壞血酸以及錳等一些微量元素。

    采用無血清培養基培養雜交瘤細胞制備單抗，有利于單抗的純化，有助于大規模，可減少細胞污染的機會，且成本較低。但無血清培養細胞的率低、細胞密度小，影響了單抗的產量；同時無血清培養基還缺少血清中保護細胞免受環境中蛋白酶損傷的抑制因子等。盡管如此，無血清培養基終究會成為雜交瘤細胞培養的理想的培養基。