感覺態細胞描述的是細胞所處的一種狀態,在這種狀態下,細胞膜可以允許外源重組質粒進入細胞內部,且不會被限制性核酸內切酶水解。
感覺態細胞的實驗操作步驟:
將電轉杯和微量離心管至于冰上。
從冰箱取出電轉感受態細胞,放置在冰盒中直至*融化。
當細胞溶解*后,輕輕拍打混勻。取出細胞至置于冰上的預冷微量離心管中。
如果使用克隆或連接試劑盒的連接Buffer,取熱滅活的連接產物到細胞中(沒有進行熱滅活的連接產物會抑制轉化反應),用槍頭輕輕攪動;不要上下吹打混勻,這樣會產生氣泡并使細胞升溫。使用連接產物會引起電轉過程中的電弧。
輕輕的將細胞/DNA混合物轉移至預冷的電轉杯中,注意避免產生氣泡。用手指快速地將試管向下輕彈,使細胞沉積在井電轉杯的底部。根據以上推薦的電轉條件進行電轉。
在脈沖10s內,加RecoveryMedium到電轉杯,用槍上下吹打重懸細胞,然后將含有細胞的培養基轉移到無菌培養管中。
將培養管放在搖床上,37℃培養1h。
從培養管中取轉化后的細胞涂布于含特定抗生素的LB(或其他培養基)瓊脂糖平板上。
注意事項
①600nm波長處的OD值超過0.5要重新接種,重新培養;
?、谠撨^程中所有用到的培養基均是無抗性的。